一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?span>
本法為以SimplyGreen HLB(60mg/3mL)柱開發(fā)的針對(duì)動(dòng)物源食品 (豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品 )中硝基呋喃類代謝物殘留檢測(cè)的樣本前處理凈化方法，HPLC法作為檢測(cè)手段。SimplyGreen HLB(60mg/3mL)柱凈化效果良好，回收率滿足測(cè)試要求，重現(xiàn)性好，與知名廠商同型號(hào)柱性能相當(dāng)。
二、實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)物
四種硝基呋喃類代謝物：呋喃它酮代謝物5-嗎啉甲基-3-氨基-2-噁唑烷基酮 (縮寫AMOZ,
CAS:43056-63-
9)、呋喃西林代謝物氨基脲 (縮寫SEM,
CAS:563-41-7 )、呋喃妥因代謝物1-氨基-2-內(nèi)酰脲 (縮寫AHD, CAS:2827-56-7)和呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-噁唑烷基酮(縮寫AOZ, CAS:80-65-9)。
三、應(yīng)用范圍
本方法適用于動(dòng)物源性食品包括豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品(魚類、蝦蟹類和貝類)中硝基呋喃類代謝物殘留檢測(cè)。
四、參考標(biāo)準(zhǔn)
《GB/T 20752-2006 豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測(cè)定
液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》和《農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-2-2008 水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物殘留量的測(cè)定》。
五、實(shí)驗(yàn)材料
SimplyGreen HLB固相萃取柱60mg/3mL；W品牌HLB固相萃取柱60mg/3mL。
六、實(shí)驗(yàn)方法
1、樣品待測(cè)溶液制備
(1) 樣品稱取脫脂 稱取待測(cè)樣品2 g(精確到0.01 g)，置于50 mL離心管中加入10 mL甲醇-水混合物(2:1)，振蕩混勻10 min， 4000 r/min離心10 min，吸取清液棄掉、離心管中試樣備用。
(2)水解衍生化 向上述離心管中加入20 mL0.2
mol/L鹽酸，振蕩混勻10 min，后加入0.4 mL
0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛(0.075 g 2-硝基苯甲醛溶于10 mL 二甲亞砜)，渦旋混勻1
min，置于37 ℃恒溫振蕩器水浴中避光反應(yīng)16h。
將上述衍生液，放置至室溫，加入5 mL0.1 mol/L磷酸氫二鉀溶液，用1
mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH到約7.4， 4000 r/min離心10 min，上清液(對(duì)脂肪含量多的試樣，可加入5 mL正己烷，振蕩2 min，4000 r/min離心5
min 吸取并棄掉正己烷)待凈化。
2、SPE柱凈化
(1)活化：依次用5 mL甲醇、10 mL水活化。
(2)上樣和洗脫：取上述備用液控制流速小于2 mL/min過柱。待樣液全部通過后用10 mL水淋洗上樣柱，棄去全部流出液并真空抽干，然后用5 mL乙酸乙酯洗脫柱子上的待測(cè)成分。
(3)重新溶解：收集洗脫液，于40℃氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入1 mL 乙腈/水(1:2, v/v)溶液溶解殘余物混勻，0.22 μm
濾膜過濾，供高效液相色譜測(cè)定。
3、HPLC條件
設(shè)備：Waters Alliance 2690 色譜柱：Welch Ultimate XB-C18 (250×4.6mm，5 μm) 檢測(cè)器：Waters
2487 雙波長(zhǎng)檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：275nm 流動(dòng)相：A:乙腈 B:0.01mol/L乙酸銨（0.77g乙酸銨，1000 mL水溶解，甲酸調(diào)pH 3.5 ）
洗脫方式：梯度洗脫
表1 洗脫梯度條件
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時(shí)間/min
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A/%
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b/%
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|
0.01
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15.0
|
85.0
|
|
16.50
|
40.0
|
60.0
|
|
17.00
|
15.0
|
85.0
|
|
22.00
|
15.0
|
85.0
|
柱溫：30 ℃
流速：1.0 mL/min
進(jìn)樣量：20 μL
七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1、添加水平為0.5mg/kg豬肉基質(zhì)中四種硝基呋喃代謝物衍生物的添加回收結(jié)果
表2 添加水平為0.5mg/kg豬肉基質(zhì)中四種硝基呋喃代謝物衍生物的添加回收結(jié)果
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四種硝基呋喃代謝物衍生物名稱
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回收率（%）
|
平均回收率（%）
|
PSD（%）
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1
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2
|
3
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|
NP-AMOZ(呋喃它酮代謝物衍生物)
|
97.20
|
102.00
|
97.40
|
98.90
|
2.70
|
|
NP-AOZ(呋喃唑酮代謝物衍生物)
|
98.20
|
98.80
|
94.60
|
97.20
|
2.30
|
|
NP-AHD(呋喃妥因代謝物衍生物)
|
94.60
|
101.60
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96.80
|
97.70
|
3.70
|
|
NP-SEM(呋喃西林代謝物衍生物)
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96.60
|
97.60
|
94.20
|
96.10
|
1.80
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表3 W品牌同型號(hào)柱，添加水平為0.5mg/kg豬肉基質(zhì)中四種硝基呋喃代謝物衍生物的添加回收結(jié)果
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四種硝基呋喃代謝物衍生物名稱
|
回收率（%）
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平均回收率（%）
|
PSD
（%）
|
|
1
|
2
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NP-AMOZ(呋喃它酮代謝物衍生物)
|
97.00
|
98.40
|
97.70
|
1.00
|
|
NP-AOZ(呋喃唑酮代謝物衍生物)
|
101.20
|
97.60
|
99.40
|
2.60
|
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NP-AHD(呋喃妥因代謝物衍生物)
|
101.60
|
101.00
|
101.3
|
0.40
|
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NP-SEM(呋喃西林代謝物衍生物)
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96.00
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96.80
|
96.40
|
0.60
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2、添加水平為0.5mg/kg豬肉基質(zhì)中四種硝基呋喃代謝物衍生物的紫外檢測(cè)色譜圖
圖1 添加水平為0.5mg/kg豬肉基質(zhì)中四種硝基呋喃代謝物衍生物的紫外檢測(cè)色譜圖
