氨基酸對動(dòng)物的生長、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及動(dòng)物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的正常代謝都有重要的作用，而且蛋白質(zhì)是動(dòng)物生長必需的營養(yǎng)物質(zhì)，是評價(jià)飼料營養(yǎng)成分的一種重要物質(zhì)，而氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，所以氨基酸的種類和含量也就是評價(jià)飼料質(zhì)量的根本依據(jù)，從而準(zhǔn)確檢測氨基酸的含量和種類具有重要意義。柱后衍生的方法，雖然準(zhǔn)確性高，但是耗時(shí)長、靈敏度低，所以本文采用柱前衍生的方法以縮短分析時(shí)間，增加靈敏度。同時(shí)該方法得到的氨基酸衍生物在-20℃可保存數(shù)月，克服了柱前衍生法衍生物不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，另外該方法準(zhǔn)確性高，用標(biāo)準(zhǔn)品做未知樣品進(jìn)行檢測，檢測的含量與標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)示值非常接近。

(1) 樣品前處理

酸水解法：準(zhǔn)確稱取一定量的樣品，使樣品氨基酸總量在50~75mg范圍內(nèi)，置于20~30mL安瓿瓶中，加入10mL含0.1%苯酚的6mol/L鹽酸，振搖使樣品溶解或者是樣品均勻分散在溶液中，將安瓿瓶置于-20℃冰箱中冷凍3~5分鐘，充氮后用噴燈熔封，然后置于110±1℃烘箱中水解24小時(shí)，取出冷卻，取水溶液1mL，置于濃縮管中用濃縮儀濃縮至干，加入1mL的0.1mol/L稀鹽酸溶解，用0.45μm濾器過濾后，取清液貯存于冰箱中，供衍生使用。

(2) 衍生方法

準(zhǔn)確量取水解后溶液及氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品200μL，分別置于1.5mL離心管中，往每只離心管中準(zhǔn)確加入正亮氨酸內(nèi)標(biāo)50μL，然后分別加入三乙胺乙腈溶液100μL和異硫氰酸苯酯乙腈溶液100μL，搖勻室溫靜置衍生1小時(shí)。衍生結(jié)束后分別加入400μL正己烷，振搖并靜置10min，取下層溶液200μL并用水稀釋到1mL，混合均勻后用0.45μm針式過濾器過濾即可。

(3) 檢測方法

3.1 溶液配制

流動(dòng)相A：稱取15.2g無水乙酸鈉，加水1850mL，溶解后用冰醋酸調(diào)pH值到6.5，然后加乙腈溶液140mL，混合均勻并用0.45μm濾器過濾流動(dòng)相B：80%乙腈水溶液

3.2 高效液相檢測條件

儀器：LC-10F 高效液相色譜儀

色譜柱：Venusil® AA氨基酸分析專用柱4.6×250mm，5μm，100?

流 速：1mL/min；進(jìn)樣量：10μL

檢測波長：254nm；柱 溫：40℃

檢測梯度如表1















 

(4) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

4.1 液相條件的建立

樣品中氨基酸含量比較低，而且直接檢測溶劑效應(yīng)較大，經(jīng)過衍生后直接檢測樣品中的氨基酸不能完全分離，本文通過用水稀釋衍生溶液的方法降低檢測中的溶劑效應(yīng)，并且經(jīng)過優(yōu)化流動(dòng)相梯度使18種氨基酸得到良好的分離。但是實(shí)際檢測過程中相同的檢測條件下，儀器不同，分離效果差別較大，有的甚至都完全分不開，為此本文還開發(fā)了一種基礎(chǔ)檢測條件，可以根據(jù)儀器的自身特點(diǎn)，稍加調(diào)整流動(dòng)相的比例即可使18種氨基酸的到較好的分離?；A(chǔ)檢測條件如表2所示。

4.2 檢測方法的穩(wěn)定性、線性及準(zhǔn)確性

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品按照1.3方法衍生后，相同的條件下連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表3所示。由結(jié)果可知該方法比較穩(wěn)定，可以用來檢測氨基酸樣品，其實(shí)驗(yàn)譜圖如圖1所示。根據(jù)儀器對各個(gè)物質(zhì)的響應(yīng)情況， 將氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋成2.5μmol/mL(胱氨酸為1.25μmol/mL)、1.25μmol/mL(胱氨酸為0.625μmol/mL)、0.5μmol/mL(胱氨酸為0.25μmol/mL)、0.25μmol/mL(胱氨酸為0.125μmol/mL)、0.125μmol/mL(胱氨酸為0.0625μmol/mL)5個(gè)濃度，然后根按照1.3的衍生方法同時(shí)衍生處理，樣品經(jīng)稀釋過濾后在相同的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)樣，依據(jù)進(jìn)樣濃度X(μmol/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，根據(jù)各個(gè)物質(zhì)峰高、噪音，遵循S/N=3計(jì)算出最低檢出限，回歸方程及檢出限見表3?？梢?，在選定的液相色譜條件下氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)與濃度呈良好的線性關(guān)系。

為了驗(yàn)證建立方法的準(zhǔn)確性，本文用Sigma氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品為樣品，以博納艾杰爾科技的標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)準(zhǔn)品通過相同的方法衍生和檢測得出檢測值與標(biāo)示值之間的偏差，除胱氨酸外，偏差均小于3%，接近標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)示值，證明該方法準(zhǔn)確性高，檢測效果穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4。因?yàn)榘腚装彼嵩趬A性環(huán)境下能夠轉(zhuǎn)化成胱氨酸，所以經(jīng)堿水解后胱氨酸的含量不穩(wěn)定，此外有時(shí)兩個(gè)半胱氨酸殘基會發(fā)生二硫鍵交聯(lián)，經(jīng)異硫氰酸苯酯衍生后的胱氨酸也不穩(wěn)定，非常容易分解，所以胱氨酸的相關(guān)系數(shù)和偏差都比較大。

4.3 樣品檢測結(jié)果

按照上述方法檢測處理后的飼料樣品可得色譜圖如圖2、圖3，通過單點(diǎn)校正法可以得出樣品1和樣品2中含有標(biāo)準(zhǔn)品中的17種氨基酸。

樣品中的17種氨基酸均能得到良好的分離，這說明在有基質(zhì)干擾的情況下本文建立的這種方法同樣適用，而且樣品連續(xù)進(jìn)樣重復(fù)性非常好，未出現(xiàn)樣品變質(zhì)或者峰型變差的現(xiàn)象，證明本文建立的方法在有基質(zhì)干擾的情況下也同樣克服了衍生氨基酸容易分解的問題。

4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

按照上述實(shí)驗(yàn)條件，可以準(zhǔn)確檢測飼料樣品中17種氨基酸，同時(shí)檢測的靈敏度及線性都能滿足檢測的要求，而且本方法準(zhǔn)確性高，與樣品中含有氨基酸的真值偏差非常小，所以該方法可以準(zhǔn)確的檢測飼料樣品中的氨基酸。

(4) 訂貨指南